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Análise histomorfométrica da cicatrização de feridas cutâneas tratadas com acupuntura: Estudo em ratos.

Histomorphometric analysis of skin wound healing undergoing acupuncture therapy: Study in rats.
  • Elidiane de Lemos Vasconcelos Silva
  • José Alex Alves dos Santos
  • Bartolomeu José dos Santos Júnior
  • Maria Fernanda Aparecida Moura de Souza
  • Rogélia Herculano Pinto
  • Francisco Carlos Amanajás de Aguiar Júnior

RESUMO

Declaração da ausência de conflitos de interesse: Declaramos que não há conflitos de interesses por parte dos autores acima mencionados.

Objetivo: Investigar os efeitos da terapia acupuntural em feridas cutâneas cirurgicamente induzidas em um modelo animal através de análise histomorfométrica. Metódos: Uma ferida excisional circular dérmica foi realizada no dorso tricotomizado de quarenta ratos machos Wistar. Os animais foram distribuídos aleatoriamente para tratamento ou grupo controle. Ratos tratados receberam a terapia de acupuntura diariamente após cirurgia. Agulhas Ting foram mantidas em torno das extremidades da ferida, durante cinco minutos. O grupo controle não foi tratado. Espécimes da biópsia de pele de ratos sacrificados no dia 3, 7, 14 e 21 dias pós-operatórios foram processados para histologia. As amostras histológicas foram coradas com hematoxilina e eosina e picrossirius red, analisadas por microscopia de luz e fotografadas. Células inflamatórias, fibroblastos / fibrócitos, vasos sanguíneos e a deposição de colágeno foram quantificados através do software ImageJ. Para a análise estatística, o teste T-Student foi realizado. Resultados: Uma redução no número de células inflamatórias e vasos sanguíneos no 7º (p = 0,001 e p = 0,01) e 14º (p = 0,003 e p < 0,001) dias pós-operatórios foi observada no grupo tratado. A quantidade de fibroblastos / fibrócitos também diminuiu neste grupo, no 14º dia após a cirurgia (p < 0,001), no entanto, um aumento na deposição de colágeno foi observado no 7º (p = 0,02) e no dia 21º (p = 0,01) dias pós-operatórios. Conclusão: O uso de acupuntura no pós-operatório afetou a contagem de células inflamatórias, fibroblastos / fibrócitos, vasos sanguíneos e a deposição de colágeno durante a cicatrização de feridas cutâneas de ratos.
Palavras-chave: ferida; acupuntura; ratos.

Abstract

Objective: To investigate the effects of acupuncture therapy in surgically-induced skin wounds in an animal model by histomorphometric analysis. Methods: A circular dermal excision wound was performed on the dorsum of fourty male wistar rats. The animals were randomly assigned to treatment or control groups. Treated rats received daily acupuncture therapy after surgery. Ting needles were maintained around from the ends of the wound for five minutes. Control group received no treatment. Skin biopsy specimens of sacrificed rats on the 3rd, 7th, 14th and 21st postoperative days were processed for histology. The histological specimens were stained with hematoxylin and eosin and picrosirius red, analyzed by light microscopy and photographed. Inflammatory cells, fibroblast/fibrocytes, blood vessels and collagen deposition were quantified by using the software Imagej. For statistical analysis, the Student’s T test was performed. Results: A reduction in inflammatory cells and blood vessels number on 7th (p=0,001 and p=0,01) and on 14th (p=0,003 and p < 0,001) postoperative days was observed in the treated group. Quantity of fibroblasts/fibrocytes also decreased in this group on 14th day after surgery (p < 0,001), however, an increase of collagen deposition was observed on 7th (p=0,02) and on 21st (p=0,01) postoperative days. Conclusion: The use of postoperative acupuncture therapy affected the count of inflammatory cells, fibroblasts/fibrocytes, blood vessels and the collagen deposition during skin wound healing in rats.
Keywords: wound; acupuncture; rats.

INTRODUÇÃO

O reparo de feridas cutâneas é um processo fisiológico essencial, progressivo e complexo que envolve diversos eventos bioquímicos, celulares e teciduais que se iniciam imediatamente após o dano tecidual. Possui a finalidade de devolver a função e integridade dos tecidos lesados1.

Os eventos iniciais do processo de reparo estão voltados para o tamponamento dos vasos rompidos durante a lesão. Imediatamente após o estímulo lesivo, devido à influência nervosa através de descargas adrenérgicas e à ação de mediadores inflamatórios oriundos de mastócitos, ocorre vasoconstrição local como primeira resposta2.

A lesão endotelial direta desencadeia a deposição, recrutamento e ativação de plaquetas ocasionando a formação de um trombo plaquetário. Este trombo associado à fibrina e a eritrócitos é responsável pela oclusão do vaso rompido, impedindo a perpetuação de perda elementos sanguíneos e fornecendo a primeira matriz para células atuantes no processo de reparo3.

Mediadores liberados pelas plaquetas ativadas, como fator de crescimento transformante (TGF-ɑ), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), tromboxanos e fator ativador de plaquetas (PAF) se difundem pela matriz provisória formando um gradiente quimiotático, orientando a migração de células inflamatórias. Neutrófilos são inicialmente coletados pelo trombo e posteriormente migram para a superfície da úlcera formando primeira barreira contra a invasão de microrganismos. Estes liberam ativamente quimiocinas que recrutarão, além de outros neutrófilos, macrófagos e fibroblastos3.

Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação de mediadores químicos, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada. Estas células são importantes na formação do tecido de granulação e deposição de matriz extracelular, migrando da borda da úlcera para o centro. Com o aumento do número de fibroblastos ativados iniciase a produção de fibrilas de colágeno localmente, induzindo angiogênese na região. O processo de neovascularização é fundamental neste estágio, pois permite o aporte de nutrientes para as células metabolicamente ativas3,4.

O processo de reepitelização se inicia imediatamente após a lesão pela proliferação de células da camada basal presentes nas bordas da úlcera, havendo a deposição gradual do tecido de granulação, a reepitelização é rapidamente estabelecida5. Com a evolução do processo de reparo, a matriz extracelular passa gradualmente por modificações estruturais, que devido migração de macrófagos, fibroblastos e a neoformação vascular, permitem continua deposição de colágeno3,4,5.

Simultaneamente aos avanços na compreensão dos diversos fatores envolvidos no processo de cicatrização, há uma crescente preocupação e descoberta de novos recursos e tecnologias para intervenção no tratamento de feridas cutâneas6. Os tratamentos em feridas cutâneas são comumente realizados através de três tipos clássicos de curativos: passivo, interativo e ativo. O passivo apenas protege e mantém o leito da ferida úmida para a cicatrização. O interativo diminui a quantidade de exsudato da ferida, mas não interfere na umidade necessária para processo de reparação tecidual, o que permite que a pele adjacente permaneça seca. Os ativos auxiliam no processo da cicatrização e reduzem o tempo de recuperação criando, assim, um ambiente favorável na interface da ferida com o curativo7.

A acupuntura é uma técnica originária da Medicina Tradicional Chinesa (MTC), que vem sendo utilizada há milênios como forma de tratamento e prevenção de diversas enfermidades. O nome acupuntura deriva dos radicais latinos acus e pungere, que significam respectivamente agulha e puncionar e visa à terapia e cura de enfermidades pela aplicação de estímulos através da pele com a inserção de agulhas em pontos específicos denominados acupontos8. O potencial elétrico das agulhas de acupuntura constitui um estímulo que age sobre as terminações nervosas livres existentes nesses pontos, alterando o potencial da membrana celular, desencadeando o potencial de ação e a condução de estímulo nervoso9.

Embora a maioria dos acupontos esteja localizada próxima a nervos ou ramos importantes de nervos periféricos, não há nenhuma evidência que haja a presença de novas estruturas ou estruturas especiais abaixo destas regiões. No entanto, estudos histológicos revelaram haver uma distribuição relativamente densa e concentrada de componentes neurais e substâncias neuroativas imediatamente abaixo dos acupontos utilizados rotineiramente na prática acupuntural10.

O método terapêutico da acupuntura possui diversos efeitos clínicos como: anti-inflamatório, analgésico, relaxante muscular, sedativo e indutor da imunidade9,11,12. A Organização Mundial de Saúde (OMS) reconhece que a acupuntura poderia servir como tratamento principal ou complementar para diversas patologias, como por exemplo: problemas gastrointestinais, dor crônica e processos alérgicos13. Além disso, vários estudos têm demonstrado que a acupuntura apresenta uma influência profunda sobre distúrbios físicos e emocionais, sendo recomendável a combinação dessa técnica com outros tratamentos14. Por ser uma terapia eficaz, de fácil acesso e de baixo custo, tem atraído cada vez mais estudos científicos, no entanto, ainda são escassos os relatos na literatura de estudos que avaliem os efeitos locais da acupuntura no processo cicatricial de feridas cutâneas.

Diante do exposto, o presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia acupuntural em feridas cutâneas cirurgicamente induzidas em modelo animal através de análise histomorfométrica. Foram analisados os efeitos desta terapia sobre as seguintes variáveis histopatológicas: infiltrado inflamatório, angiogênese, proliferação fibroblástica e deposição de colágeno.

MÉTODOS

Foram utilizados 40 ratos de linhagem Wistar (Rattus Norvegicus Albinus), machos, adultos jovens, pesando entre 200g e 300g e oriundos do Biotério do Departamento de Nutrição – Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos durante 10 dias no Biotério do Centro Acadêmico de Vitória – CAV/UFPE para adaptação ao novo ambiente e durante todo o período experimental receberam ração e água ad libitum. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais de Ciências Biológicas da UFPE, sob processo nº 23076.024607/2008-62.

Os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos (cada grupo com 20 animais). Os animais foram pesados para determinação da quantidade de solução anestésica a ser empregada para cada animal, e, portanto, sendo anestesiados pela aplicação por via intraperitoneal de cloridrato de cetamina na razão de 0,1ml por 100g de peso corporal e cloridrato de xilazina na razão de 0,05ml por 100g de peso. Em seguida, procedeu-se a tricotomia na região dorsal mediana dos animais. Com a pele exposta, a área foi limpa e foi realizada a antissepsia com solução de álcool 70%. As feridas cirúrgicas foram realizadas através da incisão de bisturi número 15 no dorso do animal, paralelamente ao eixo da coluna vertebral. As mesmas foram realizadas com diâmetro de 2 cm, padronizando-se o tamanho e a forma, conduzida em igual profundidade, até o alcance do plano muscular.

O dia da cirurgia ficou denominado dia 0 (zero), após as 24 h no grupo teste, foi dado início à terapia de acupuntura diariamente até o 21º dia. A terapia consistia na inserção diária de agulhas Ting, de tamanho 0,20x0,15 mm, em torno da extremidade da ferida por cinco minutos cada dia (grupo TA). O grupo controle não recebeu nenhum tratamento.

Decorridos 3, 7, 14 e 21 dias após o ato cirúrgico, 5 animais de cada grupo (TA e controle) foram escolhidos aleatoriamente e sacrificados pela aplicação por via intraperitoneal de anestésica em dose letal. Imediatamente após, um fragmento contendo a ferida cirúrgica em toda sua extensão e profundidade foi retirada através de um bisturi número 11.

O material coletado foi clivado e mergulhado em uma solução de formol a 10 % neutro tamponado (NBF), permanecendo nesta solução pelo período de 48 horas. Após esse procedimento, os fragmentos foram desidratados em álcool etílico em concentrações crescentes, diafanizados pelo xilol, impregnados e incluídos em parafina. Os blocos foram cortados em micrótomo ajustado para 5µm. Assim, os cortes obtidos foram colocados em lâminas untadas com albumina e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37ºC, por 24 horas para secagem.

Os cortes foram submetidos à técnica de coloração pela Hematoxilina-Eosina (H.E.) para contagem de células inflamatórias e de fibroblastos e corados pelo picrossirius-red para avaliação das fibras colágenas totais. As imagens histológicas destas lâminas foram capturadas por câmera digital (Moticam 3000) acoplada ao microscópio óptico (Nikon E-200), sob foco fixo e clareza de campo, obtendo-se 10 campos por lâmina com aumento final de 400X. As fotomicrografias foram avaliadas através do software ImageJ versão 1.44 (Research Services Branch, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.), os plugins “colour deconvolution”, “cell counter” e “threshould” foram utilizados na contagem celular e quantificação de fibras colágenas nos cortes histológicos.

Os dados obtidos da avaliação histomorfométrica foram normalizados para o controle (Controle=100%) e compa rados estatisticamente através do teste t de student com o intuito de se verificar possíveis diferenças entre os grupos nos períodos de 3, 7, 14 e 21 dias. Foi adotado o nível de significância de 5% ou p < 0,05.

RESULTADOS

Durante o experimento, os animais de ambos os grupos foram submetidos diariamente a avaliações macroscópicas e não apresentaram sinais de infecção secundária ou quaisquer outros tipos de intercorrências. Não foram identificados microscopicamente focos de exsudação purulenta ou de reação de corpo estranho nas feridas avaliadas e em ambos os grupos a área eleita para a análise histológica foi àquela preenchida por tecido conjuntivo neoformado abaixo da porção superficial da lesão.

Microscopicamente, notou-se inicialmente com predomínio de polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos) e em seguida de mononucleares (macrófagos e linfócitos) (3º dia e a partir do 14º dia pós-operatório respectivamente) em ambos os grupos. A partir da análise histomorfométrica, constatou-se que as maiores médias de células inflamatórias e de vasos sanguíneos observadas no grupo TA foram durante o 3º dia de reparo. No grupo controle essas médias foram maiores durante o 3º e 7º dias pós-operatórios (Tabela 1). Comparando-se os grupos, a média do infiltrado inflamatório e da quantidade de vasos sanguíneos foram significantemente reduzidas no 7º (p=0.01 para ambas variáveis) e no 14º (p < 0.001 para ambas variáveis) dia de reparo no grupo TA (Tabela 1 e Gráfico 1).

Gráfico I. Valor médio percentual da quantidade de células inflamatórias e vasos sanguíneos do grupo tratado com acupuntura em comparação com o grupo controle (controle = 100%). * p < 0,05.
Tabela I- Média e desvio-padrão da contagem de fibrócitos/fibroblastos, células inflamatórias, vasos sanguíneos e deposição de colágeno nos diferentes grupos de acordo com a cronologia do reparo cicatricial.

Tabela I- Média e desvio-padrão da contagem de fibrócitos/fibroblastos, células inflamatórias, vasos sanguíneos e deposição de colágeno nos diferentes grupos de acordo com a cronologia do reparo cicatricial / Gráfico I. Valor médio percentual da q u a n t i d a d e de células inflamatórias e vasos sanguíneos do grupo tratado com acupuntura em comparação com o grupo controle (controle = 100%). * p < 0,05." >

Quanto ao número de fibroblastos/fibrócitos e a deposição de colágeno, tanto o grupo TA e grupo controle apresentaram as maiores médias durante 21º dia de reparo. No entanto, enquanto o grupo controle apresentou um aumento gradual na média de fibroblastos/fibrócitos durante o processo cicatricial, o grupo TA apresentou um segundo pico na média destas durante o 7º dia pós-operatório (Tabela 1). Comparando-se os grupos, a média de fibroblastos/fibrócitos foi significantemente reduzida no grupo TA durante o 14º (p< 0.001) dia e a deposição de colágeno foi estatisticamente maior durante o 7º (p=0,02) e 21º (p=0.01) dias de reparo cicatricial (Tabela 1 e Gráfico 2).

Gráfico II. Valor médio percentual da quantidade de fibroblastos e colágeno total do grupo tratado com acupuntura em comparação com o grupo controle (controle = 100%). * p< 0,05.
Gráfico II. Valor médio percentual da quantidade de fibroblastos e colágeno total do grupo tratado com acupuntura em comparação com o grupo controle (controle = 100%).  * p<0,05.

DISCUSSÃO

Durante o processo fisiológico de reparo de feridas cutâneas, três estágios histomorfológicos interdependentes podem ser observados: há um estágio inflamatório inicial, seguido por um de proliferação celular e vascular e deposição de matriz finalizando o reparo após o processo de remodelação da matriz depositada. Embora possuam características próprias, há certa sobreposição dos estágios havendo concomitante ocorrência destes1.

Neste estudo, o uso da acupuntura durante o processo de reparo das feridas cutâneas em ratos ocasionou uma diminuição significativa no número de células inflamatórias e de vasos sanguíneos durante o 7º e 14º dias pós-operatórios. De fato, Lee et al11 e Nakajima et al12 constataram um efeito anti-inflamatório da acupuntura realizada ao redor de feridas cutâneas e de fraturas ósseas em ratos.

Quando uma agulha de acupuntura é inserida em uma determinada região da pele ou ponto e repetidamente manipulada em diferentes direções, há uma lesão tecidual e reações bioquímicas locais, com a liberação de diversas substâncias e mediadores inflamatórios locais. No entanto, ao contrário da maioria das outras formas de lesão tecidual, a acupuntura ocasiona uma resposta terapêutica a nível local e sistêmica15.

As células inflamatórias assumem papel fundamental durante o processo de reparo: neutralizando, destruindo microrganismos e outras partículas e substâncias estranhas, promovendo a resolução do coágulo de fibrina e matriz extracelular provisória, liberando inúmeras citocinas e fatores de crescimento que induzem a angiogênese e reepitelização16 . No entanto, a persistência de células inflamatórias durante o processo de reparo pode atuar de forma deletéria17. Além da liberação contínua de citocinas e fatores de crescimento, as células inflamatórias exercem influência sobre o tecido circundante gerando grande quantidade de óxido nítrico (ON) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Tanto ON como ERO são moléculas que podem ocasionar efeitos deletérios nas células presentes no leito da ferida18.

Além disso, uma redução na quantidade de macrófagos ativados durante processo de reparo parece favorecer a formação de uma cicatriz fibrosa menos perceptível clinicamente19.

A angiogênese, que é parte integrante do processo de reparo de feridas, fornece nutriente e oxigênio para a proliferação celular e auxilia a formação de matriz provisória no leito cicatricial16. Uma redução de células inflamatórias, particularmente de macrófagos, durante o processo de cicatrização ocasiona uma diminuição na liberação de fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) influenciando diretamente a multiplicação de células endoteliais e formação de novos capilares20.

No entanto, em um estudo realizado em ratos a acupuntura induziu uma redução na expressão de citocinas pró-inflamatórias como interleucina 1-ɑ (IL1- -ɑ) e fator de necrose tumoral-ɑ (FNT-ɑ) na fase inflamatória do reparo de feridas cutâneas, a expressão de VEGF foi fortemente aumentada na fase proliferativa, culminando em uma maior neovascularização21.

A formação de colágeno é reconhecidamente um passo inicial para a resolução do processo cicatricial. A deposição de matriz é favorecida pela multiplicação maciça de fibroblastos e diminuição do infiltrado inflamatório. Juntamente com a proliferação de novos vasos sanguíneos, o leito da ferida é, por fim, totalmente preenchido pelo tecido de granulação, lentamente este é substituído por uma massa fibrosa -cicatriz- decorrente de uma continua deposição de fibras colágenas. A resolução final do processo de reparo ocorre somente após a maturação e remodelagem da matriz extracelular cicatricial1,3,4,5.

Observamos que a acupuntura proporcionou um aumento significativo na deposição de fibras colágenas durante o 7º e 21º dias de reparo tecidual, e que mesmo havendo uma diminuição significativa no número de fibroblastos durante o 14º dia, a produção de colágeno não foi comprometida. A diminuição no número de fibroblastos pode ter sido ocasionada pela redução do número de células inflamatórias durante o processo de cicatrização, particularmente de macrófagos, e consequente menor liberação de citocinas e fatores de crescimento indutoras da proliferação de fibroblastos como, por exemplo, a IL-1 e FNT-ɑ 22.

A deposição de colágeno de maneira adequada e organizada é importante clinicamente. O colágeno depositado inicialmente é mais delicado que aquele presente na pele normal, e tem uma organização paralela à este órgão. Com o tempo o colágeno inicial (colágeno tipo III) é reabsorvido e um colágeno mais espesso (colágeno tipo I) é produzido e organizado ao longo das linhas de tensão23. A ferida apresentará após 3 meses do início do reparo cerca de 80% da força tênsil de uma pele normal22. A formação da matriz extracelular é resultante de um balanço entre a deposição (síntese) e degradação de colágeno. Sendo assim, o significante aumento na quantidade de colágeno observado após o tratamento com acupuntura pode ter sido fruto de uma maior deposição ou ainda de uma diminuição em sua degradação, o que pode contribuir com restabelecimento da pele lesionada precocemente e favorecer o pronto restabelecimento de sua da força tênsil.

Em fetos, cujo processo de reparo cutâneo ocorre mais rapidamente e há a ausência ou redução de cicatrizes fibrosas alguns fatores como: diminuição ou ausência do processo inflamatório, diminuição da angiogênese e consequente redução da tensão de oxigênio no leito cicatricial e maior rapidez na deposição de colágeno são reportados19,24. Desta forma, os efeitos observados do uso contínuo da acupuntura ao redor da ferida cirurgicamente induzida podem indicar uma maior rapidez de resolução e menor formação de cicatriz da área cutânea lesionada. Estudos posteriores podem melhor elucidar os resultados obtidos e identificar os exatos mecanismos de ação da terapia acupuntural.

CONCLUSÃO

O uso da terapia acupuntural afetou a contagem de células inflamatórias, fibroblastos / fibrócitos, vasos sanguíneos e a deposição de colágeno durante o processo de cicatrização de feridas cutâneas em ratos.

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