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Avaliação da densidade de mastócitos durante o processo de cicatrização de feridas bucais induzidas tratadas com extrato de urucum: estudo em ratos

Evaluation of density of mast cells during the healing process of wound induced oral treated with extract urucum: study in rats
  • Maria Fernanda Aparecida Moura de Souza
  • José Alex da Silva Santos
  • Elidiane de Lemos Vasconcelos Silva
  • Francisco Carlos Amanajás de Aguiar Júnior

RESUMO

RESUMO: O uso do urucum é amplamente difundido em nossa cultura e comumente utilizado na indústria alimentícia como corante natural. O reparo de feridas bucais é um processo fisiológico complexo e progressivo que envolve diversos eventos celulares, teciduais e bioquímicos. Mastócitos são células que atuam ativamente no processo de cicatrização de feridas. Avaliar a densidade de mastócitos em feridas bucais induzidas cirurgicamente em ratos tratados com extrato de urucum contendo 5,5% de bixina. Utilizou-se 30 ratos Wistar, machos, divididos aleatoriamente em 2 grupos com 15 animais cada: grupo tratado com o extrato de urucum e grupo controle. Após 6 horas, 24 horas, 3 dias, 7 dias e 14 dias após realização do procedimento cirúrgico para confecção das feridas, os animais foram sacrificados. Após processamento histológico dos fragmentos linguais, os preparados histológicos obtidos foram corados com azul de toluidina 1%, analisados e fotografados em microscópio óptico com aumento final de 400X. Foi realizada uma análise quantitativa através de software Image J. Os resultados obtidos foram submetidos ao teste t de student e valor de p considerado significativo foi < 0,05. A quantidade de mastócitos foi significantemente reduzida nas 24h pós-operatórias e aumentada no 14º dia de reparo tecidual. O uso tópico do extrato de urucum influenciou a densidade de mastócitos durante o processo de reparo da mucosa lingual em ratos.

Palavras-chave: mastócitos; úlcera; língua; reparo tecidual; urucum.


SUMMARY - The use of annatto is widely spread in our culture and it is commonly used by the food industry as a natural pigment. Oral wound repair is a complex and progressive physiological process, which involves several different cellular, tissue and biochemical events. Mast cells are cells that actively work in wound healing process. To evaluate mast cell density in surgically open oral wounds in rats and treated with an extract of annatto containing 5.5% of bixin. Thirty (30) male Wistar rats were randomly divided into two groups of 15 rats each: group treated with the annatto extract and the control group. 6 hours, 24 hours, 3, 7 and 14 days after the surgical procedure the animals were sacrificed. After histological preparation of tongue tissues, the material obtained was dyed with toluidine blue 1%, analyzed and photographed with an optical microscope with final zoom of 400X. A quantitative analysis was carried out using the Image J software. The results were submitted the t de student test and the value of p considered relevant was < 0.05. The quantity of mast cells was significantly reduced 24 hours after surgery and increased on the 14th day of tissue repair. The topical use of annatto extract influenced mast cells density during the process of tongue tissue repair in rats.

Key words: ulcer; tongue; tissue repair; annatto.

INTRODUÇÃO

A úlcera ou ferida traumática é a lesão mais comum dos tecidos moles da boca. Há, nestas condições, perda da integridade do epitélio, exposição da lâmina própria e em casos mais graves, envolvimento de estruturas mais profundas como tecido muscular, tecido adiposo e glândulas salivares menores1.

O reparo de feridas bucais é um processo fisiológico complexo e progressivo que envolve diversos eventos celulares, teciduais e bioquímicos que se iniciam após o dano tecidual com a finalidade de devolver a integridade e função dos tecidos lesados2. O processo de reparo tecidual pode ser dividido em três fases: (1) inflamação, (2) formação de tecido de granulação com deposição de matriz extracelular e (3) remodelação. Estas fases não são mutuamente excludentes, mas sobrepostas no tempo. O reparo completo de tecidos resulta de alternâncias sucessivas de reações anabólicas e catabólicas3.

Mastócitos são células móveis do tecido conjuntivo que se originam da medula óssea e possuem grânulos em seu citoplasma. Estão localizados na pele e em mucosas, preferencialmente próximos a vasos sanguíneos, linfáticos e feixes nervosos. Em seu citoplasma, são armazenadas diversas substâncias incluindo aminas vasoativas como a histamina, enzimas, proteoglicanos estruturais como a heparina e citocinas. Assim que são ativados, estas células aumentam em número, tamanho e granulosidade e posteriormente há a extrusão destes grânulos para o meio extracelular4. São células multifuncionais atuando em importantes processos biológicos como em reações de hipersensibilidade, doenças autoimunes, inflamação aguda e crônica, angiogênese, crescimento tumoral e remodelação cicatricial5.

O urucuzeiro - Bixa orellana L. (Família Bixaceae) é um arbusto pequeno de 3-5 m de altura, cujo tronco é revestido por casca parda e copa bem desenvolvida. Seus frutos são do tipo cápsula deiscente, ovóide, com 2 ou 3 carpelos, cobertos de espículos flexíveis, de cor vermelha, esverdeada ou parda, contendo muitas sementes pretas cobertas por um arilo ceroso de cor vermelha e odor característico6. As sementes apresentam em sua composição celulose (40-45%), açúcares (3,5 - 5,2%), óleo essencial (3%), óleo fixo (4,5 -5,5%), proteínas (13 -16%), alfa e betacarotenos, vitaminas (B1, B2, C e A) e minerais (cálcio, ferro e fósforo)7.

O corante amarelo avermelhado é obtido no pericarpo seco da semente da planta Bixa orellana L. e pode ser extraído por processos mecânicos através de atrito ou raspagem das sementes, através de solventes, ou ainda, através de processos enzimáticos. Sendo de baixo custo de produção, o urucum, conhecido internacionalmente como annatto, é utilizado em vários setores industriais em substituição a muitos corantes sintéticos. Na sua composição se encontra um carotenóide importante denominado bixina, muito abundante e lipossolúvel, cuja molécula apresenta dois grupos carboxílicos, um deles sendo um éster metílico8.

Uma das principais características dos carotenóides é a sua capacidade de reagir com radicais livres, principalmente com oxi -radicais como o super peróxido, radical hidroperoxila e o radical hidroxila. Estes radicais podem ser formados em decorrência de processos fisiológicos e patológicos como a fagocitose ou em decorrência de influências externas, como por exemplo, a exposição à radiação ultravioleta9. A atuação como quimiopreventivo do câncer 10, na modulação de respostas imunológicas11, além de suas funções nutricionais e tintoriais já estabelecidas, justificam os diversos estudos sobre o potencial biológico destes compostos.

Apesar de seu uso amplamente difundido na culinária e indústria, são escassos relatos na literatura de estudos que avaliem os efeitos do urucum, particularmente de seu carotenoide principal bixina, nos elementos celulares envolvidos no processo de reparo cicatricial de feridas bucais. Diante do exposto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a densidade de mastócitos em feridas bucais de ratos induzidas tratadas com extrato de urucum através de análise histomorfométrica.

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram utilizados 30 ratos de linhagem Wistar (Rattus Norvegicus Albinus), machos, adultos jovens, pesando entre 200g e 300g e oriundos do Biotério do Departamento de Nutrição - UFPE. Os animais foram mantidos por um período de 10 dias no biotério do Centro Acadêmico de Vitória de Santo Antão - CAV/ UFPE para adaptação ao novo ambiente e receberam durante todo o protocolo experimental ração e água e água ad libitum. O projeto da pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) animal da Universidade Federal de Pernambuco (Processo no. 23076.019993-2010-95). Os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos (cada grupo com 15 animais). No grupo tratado, após a confecção da ferida cirúrgica, a mesma foi tratada com o extrato de urucum obtido como corante natural (Extrato concentrado de Urucum – 5,5% de bixina – Marca Baculerê) por três dias. O grupo controle teve a ferida umedecida com soro fisiológico pelo mesmo período de tempo.

Os animais foram pesados para determinação da quantidade de solução anestésica a ser empregada para cada animal, e após isso, foram anestesiados pela aplicação intraperitonial de cloridrato de cetamina na razão de 0,1ml por 100g de peso corporal e cloridrato de xilazina na razão de 0,05ml por 100g de peso. Em seguida, se tracionou delicadamente a língua dos animais. Com a área exposta, a língua foi limpa e se realizou a antissepsia com solução de álcool a 70%. As feridas cirúrgicas foram realizadas através da incisão de bisturi número 15 na região dorsal mediana da língua do animal. As mesmas possuíram diâmetro de 1 cm, padronizando-se o tamanho e forma, conduzidas em igual profundidade, até o alcance do plano muscular. Decorridos 6 e 24 horas, 3,7 e 14 dias após o ato cirúrgico, 3 animais de cada grupo (tratado e controle) foram escolhidos aleatoriamente e sacrificados pela aplicação por via intra-peritonial de anestésico em dose letal. Imediatamente após, um fragmento da língua contendo a ferida cirúrgica em toda sua extensão e profundidade foi retirado através de um bisturi número 11.

O material coletado foi clivado e mergulhado em uma solução de formol a 10% neutro tamponado (NBF), permanecendo no mesmo pelo período de 48 horas. Após esse procedimento, os fragmentos foram desidratados em álcool etílico em concentrações crescentes, diafanizados pelo xilol, impregnados e incluídos em parafina. Os blocos foram cortados em micrótomo ajustado para 5 micrômetros. Assim, os cortes obtidos foram colocados em lâminas untadas com albumina e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37°C, por 24 horas para secagem.

Os cortes foram submetidos à técnica de coloração pelo azul de toluidina 1% em meio ácido, para identificação dos mastócitos e visualização, quando presentes, dos grânulos metacromáticos. As imagens histológicas destas lâminas foram capturadas por câmera digital (Moticam 3000) acoplada ao microscópio óptico (Nikon E-200), sob foco fixo e clareza de campo, obtendo-se 10 campos por lâmina com aumento final de 400X. As fotomicrografias foram avaliadas através do software Image J versão 1.44 (Research Services Branch, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.), o plugin “cell counter” foi utilizado na contagem celular. Adicionalmente foi realizada uma análise qualitativa dos resultados obtidos descrevendo a distribuição dos mastócitos na mucosa da língua durante o processo de reparo em ambos os grupos.

Os dados obtidos da contagem de mastócitos foram processados, obtendo-se a média e desvio-padrão, também sendo normalizados para o controle (controle=100%) e analisados estatisticamente através do teste de t de student com o intuito de se verificar possíveis diferenças entre os grupos nos períodos de 6 e 24 horas, 3, 7 e 14 dias. Para tanto, foi adotado o nível de significância de 5% ou p < 0,05.

RESULTADOS

Os mastócitos que continham grânulos metacromáticos citoplasmáticos intactos ou em processo de degranulação foram facilmente identificados microscopicamente quando submetidos pela técnica histoquímica do azul de toluidina a 1% (Figura 1). Aqueles que não apresentavam grânulos metacromáticos foram quantificados através de sua morfologia característica. Microscopicamente, estas células apresentaram-se com um formato que variava de redondo a oval e em alguns casos, levemente fusiforme. O núcleo era caracteristicamente central e apresentavam citoplasma abundante. Quanto à sua distribuição tecidual, os mastócitos se localizavam preferencialmente próximos de vasos sanguíneos ou de filetes nervosos e espalhados pelo tecido conjuntivo perilesional em ambos os grupos.

Figura 1. Aspecto microscópico de mastócitos corados pelo azul de toluidina a 1% apresentando metacromasia. Setas: mastócitos em processo inicial de degranulação. Aumento 1000X.

A média do número de mastócitos identificados foi menor no grupo tratado durante as 6 e 24 horas pós-operatórias e no 7º dia de reparo e foi maior no 3º e 14º dia pós-operatório quando comparado ao controle. No entanto, estas diferenças na média da densidade de mastócitos só foram estatisticamente significativas entre os grupos nas 24 horas e 14 dias de reparo tecidual (Tabela 1 e Gráfico 1).

DISCUSSÃO

Os mastócitos são células multifuncionais que podem virtualmente serem encontradas em qualquer tecido vascularizado, sendo encontradas preferencialmente próximos à vasos sanguineos, nervos, tecido muscular liso, células epiteliais, glândulas produtoras de muco e foliculos pilosos. Geralmente são numerosos em regiões anatômicas que são diretamente expostas ao meio externo, como pele, vias respiratórias, trato gastrointestinal e cavidade bucal 12,13. O núcleo desta célula é basófilo, levemente excêntrico e relativamente grande14. O formato varia de acordo com a técnica de visualização utilizada, sendo arredondado, oval ou fusiforme na microscopia óptica ou dendrítico quando observada através de microscopia eletrônica15. O mastócito é caracterizado por grânulos citoplasmáticos que ocupam 50 a 55% do citoplasma16.

Em nosso estudo, a identificação e quantificação dos mastócitos basearam-se na caracterização de sua morfologia celular pela microscopia óptica e nas propriedades tintoriais peculiares de seus grânulos citoplasmáticos, quando presentes, pelo azul de toluidina (AT).

Os mastócitos em humanos e em roedores são divididos em dois subtipos, os do tecido conjuntivo e das mucosas. O primeiro subtipo contem quimases e triptases em seu citoplasma e o segundo subtipo apenas quimases17. Apesar de possuirem a mesma morfologia celular, são células extremamente diversas fenotípicamente e funcionalmente se diferenciando também sua localização tecidual, mediadores produzidos e resposta à estímulos diversos18.

O AT é um corante acidofílico metacromático têm afinidade à componentes teciduais e celulares que possuem em sua composição sulfatos, carboxilatos e radicais fosfato. Os grânulos citoplasmáticos dos mastócitos são metacromáticos, isto se deve à presença do glicosaminoglicano sulfatado heparina que é fortemente corado pelo AT em meio ácido, apresentando uma coloração púrpura característica19.

A multifuncionalidade atribuída aos mastócitos torna-os foco de constante investigação visando estabelecer o seu papel no processo de cicatrização de tecidual20. São células que atuam diretamente em eventos importantes deste processo como: controle da resposta inflamatória, reepitelização e revascularização do tecido lesado, deposição de tecido conjuntivo temporário e consequente remodelação da matriz conjuntiva21. Uma vez ativado diretamente pela injuria tecidual, os mastócitos localizados na borda da ferida liberam diversos mediadores essenciais no desencadeamento da resposta inflamatória inicial. A vasodilatação local, o recrutamento de leucócitos circulantes na área lesionada e a ativação de macrófagos locais para a fagocitose são funções comumente associadas aos mastócitos nesta fase22.

Moléculas liberadas como: fator de necrose tumoral (FNT) e histamina favorecem a adesão leucocitária aos vasos sanguíneos4 e outras como leucotrienos, proteases, citocinas, especialmente a interleucina-8, atuam como sinais quimiotáticos para neutrófilos, basófilos, eosinófilos23.

O aumento da permeabilidade vascular e a liberação de mediadores vasoativos como histamina, protease, FNT e metabólitos do ácido aracdônico induzem a vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular24.

O urucum é uma importante fonte de corantes naturais, sendo seu uso amplamente difundido em nossa cultura e na indústria farmacêutica, têxtil, cosmética e alimentícia no Brasil e no Mundo25. O extrato de urucum é utilizado pela indústria alimentícia para colorir manteigas, queijos, óleos, produtos de panificação, sorvetes, cereais e imbutidos26. É ainda utilizado na medicina popular para o tratamento de diabetes, infecções cutâneas, queimaduras, febre, diarréia e asma27. Particularmente quanto à aplicação do urucum em alimentos, tem havido restrições severas no que se refere à quantidade permitida e a gama de produtos que pode ser adicionado, devido ao pouco conhecimento da composição e dos efeitos biológicos deste nos tecidos animais28,29.

Dentre os carotenoides presentes nas sementes de urucum, a bixina é o majoritário correspondendo cerca de 80 a 90% 28. É atribuída à bixina uma importante ação antioxidante graças à sua peculiar composição química, atuando como um potente captador de radicais livres e espécies reativas de oxigênio e, portanto, protegendo células e tecidos frente a injúrias30.

Observamos que o uso tópico da bixina no tratamento das feridas linguais provocou uma diminuição significativa no número de mastócitos nas 24 horas pós-cirúrgicas. Há escassos relatos na literatura sobre os efeitos diretos da bixina em células imunes ou no processo inflamatório. Em linfócitos esplênicos de ratos, pequenas doses de bixina diminuíram a quantidade de IgE e IgM produzidas por estas células31. Um estudo in vitro indicou haver uma ação inibitória deste carotenoide na ação das enzimas cicloxigenases (COX) 1 e 2, e que esta ação era diretamente proporcional à concentração de bixina utilizada no experimento32. Sendo assim, a diminuição na densidade de mastócitos no leito da ferida pode ter sido ocasionada por uma ação inibitória seletiva da bixina nos mecanismos celulares de síntese de mediadores inflamatórios.

Os mastócitos produzem prostaglandinas (PG), particularmente a forma PGD2, cuja síntese é dependente da ação das COXs. A PGD2 aumenta sensivelmente a vasodilatação local e, além disso, potencializa enormemente a ação da histamina liberada33. Ademais, em resposta à vasodilatação local e aumento de permeabilidade vascular, as células endoteliais ativadas liberam substâncias como: fator de células-tronco, interleucina 3 e trombina que induzem a migração, proliferação e diferenciação de mastócitos34.

Durante o 7º dia pós-operatório, observou-se diferença entre grupos com diminuição, embora não significativa, no número de mastócitos. Nesta fase do reparo, predomina a formação de tecido de granulação com eventos proliferativos como: angiogênese, proliferação de fibroblastos e re-epitelização. Todos estes processos podem ser modulados pelos mastócitos, pela liberação diferencial de mediadores biológicos como: histamina, heparina, FNT, interleucinas 6 e 8 e fatores de crescimentos diversos20.

Um aumento significativo no número de mastócitos pode ser identificado, no 14º. dia de reparo cicatricial em cerca de 60%. Este acúmulo na fase final também foi observado por Nishikori et al35, que investigou feridas cutâneas induzidas por queimadura. Nesta fase, há deposição final de matriz extracelular e remodelação da mesma. O acúmulo de mastócitos na área cicatricial ocasionaria a liberação de proteases e metaloproteinases, e ainda inibidores destas enzimas e fatores de crescimento como fator de crescimento dos fibroblastos e fator de crescimento transformante, que quando coordenadamente liberados proporcionam a substituição da matriz extracelular temporária em tecido conjuntivo denso não-modelado35. Além disso, há uma profunda sinergia funcional entre mastócitos e fibroblastos cujos estímulos químicos mútuos são temporalmente coordenados e pela evidência de uma interligação física entre estas duas células através de junções celulares36. O fenótipo dos fibroblastos ativados pode ser modificado pelos mastócitos, transformando-os em miofibroblastos, garantindo o processo final de reparo e, portanto a adequada contração cicatricial20.

O fato do tratamento com bixina a 5,5% alterar densidade de mastócitos durante o reparo de feridas bucais em modelo animal e desta célula desempenhar um papel homeostático na reparação cicatricial abre novas possibilidades para ação terapêutica e, de fato, diversos fitoterápicos vêm sendo investigados e usados no tratamento de feridas no intuito de acelerar ou influenciar beneficamente o processo de reparo cicatricial37.

CONCLUSÃO

Nosso estudo demonstrou que, apesar de culturalmente aceito e extensamente utilizado pela indústria, o extrato de urucum contendo 5,5% de bixina não é biologicamente inerte aos tecidos animais, pois induziu alterações quantitativas nos mastócitos durante o reparo de feridas bucais cirurgicamente induzidas em ratos. Estudos futuros poderão melhor elucidar os mecanismos envolvidos e validar os efeitos observados através de diferentes dosagens de seu principal carotenoide.

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