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Diferenciação de células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano em queratinócitos sobre biomembranas de cana-de-açúcar

Differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cords in keratinocytes on biomembranes of sugarcane
  • Paulo Henrique Cavalcanti de Araújo
  • Maryana Roberta Pedrosa Dias
  • José Larmatine de Andrade Aguiar
  • Márcia Bezerra da Silva
  • Eliete Cavalcanti da Silva
  • Paloma Lys de Medeiros

RESUMO

RESUMO: Avaliar a biocompatibilidade de células-tronco mesenquimais (CTMs) do cordão umbilical humano cultivadas sobre membranas do biopolímero de cana-de-açúcar e sua capacidade de diferenciar-se em queratinócitos. Metodologia: Cordões umbilicais (n=20) foram doados por puérperas do Hospital das Clínicas de Pernambuco/UFPE de acordo com protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (nº482/2010). Cada cordão teve sua veia preenchida com colagenase tipo IV para extração das CTMs. Após esse procedimento, as células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com SFB e mistura de antibióticos. A confirmação da linhagem mesenquimal foi realizada através de citometria de fluxo. A morfológica das células foi observada com o auxílio de microscópio invertido com contraste de fase. A diferenciação em queratinócitos ocorreu por volta de 14 dias, com a realização de registros fotográficos simultâneos. Resultados: As CTMs quando cultivadas sobre o biosuporte apresentaram formas variando de arredondadas a fibroblastóides e, sob efeito do diferenciador, foi possível observar agrupamentos celulares e também algumas com aspecto arredondo. Conclusão: Este estudo mostrou que o biopolímero de cana-de-açúcar é biocompatível favorecendo o crescimento e a diferenciação das CTMs em queratinócitos.


SUMMARY - Evaluate the biocompatibility of mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord cultured on sugarcane biopolymer membranes and its ability to differentiate into keratinocytes. Methods: umbilical cords (n = 20) were donated by the puerperal of Clinical Hospital of Pernambuco/UFPE according to protocol approved by the Ethics in Research (n. 482/2010). Each cord had its vein filled with collagenase type IV for the extraction of MSCs. After this procedure, the cells were cultured in DMEM medium supplemented with FBS and antibiotic mix. The confirmation of the mesenchymal lineage was performed by flow cytometry. The morphology of the cells was observed under an inverted phase contrast microscope. The differentiating keratinocytes occurred about 14 days, with simultaneous photographic records. Results: MSCs when cultured on biosuporte presented shapes ranging from rounded to fibroblast and under the effect of differentiating; we observed cell clusters and with some aspect rounded. Conclusion: This study showed that the sugarcane biopolymer is biocompatible favoring the growth and differentiation of MSCs into keratinocytes.

INTRODUÇÃO

A pele é um órgão multifuncional responsável por formar a barreira cutânea, que oferece proteção contra traumatismos, agentes químicos, invasão de micro-organismos; além de contribuir com a termorregulação, evitando-se a perda da água e assegurando o armazenamento de eletrólitos, carboidratos, lipídeos e proteínas1. Por inúmeros fatores, como queimaduras e traumas, a pele pode ser lesionada em diferentes graus de intensidade e ter sua função comprometida. Dessa forma, há um grande interesse por novas ferramentas capazes de complementar ou inovar os tratamentos especializados, a base de curativos comercializados como hidrogéis, carvão ativado e alginatos2,3.

Abordagens clínicas, como a enxertia e transplantes de órgãos, possuem relativas desvantagens devido à escassez de áreas doadoras e possibilidade de rejeição pelo receptor, o que induz a busca por produtos sintéticos ou biológicos que possam substituir ou auxiliar os métodos convencionais4. Tais fatos estimulam desenvolvimento de substitutos epidérmicos a partir do avanço científico da bioengenharia que, num futuro próximo, poderá disponibilizar ferramentas economicamente viáveis no intuito de oferecer maiores benefícios aos pacientes acometidos por lesões epiteliais5.

Diante desse cenário, os biomateriais despontam como um setor de vanguarda para a engenharia tecidual, revolucionando as pesquisas com relação ao processo de cicatrização, onde ensaios in vitro e in vivo possibilitam a investigação da interação celular com novos biosuporte6,7.

O biopolímero de cana-de-açúcar é um exopolissacarídeo sintetizado pela bactéria Zooglea sp produzido pela fermentação do melaço e constituído por monossacarídeos, tendo a glicose (87,57%) como principal constituinte. Esse biosuporte apresentou resultados satisfatórios em estudos de caráter experimental realizados para tratamentos de incontinência urinária, em ratas9 e de angioplastia da artéria femoral, em cães10.

Em vista do exposto, no presente estudo objetivou-se avaliar a utilização de biopolímeros de cana-de-açúcar (biomembranas) como suporte no cultivo de queratinócitos obtidos a partir da diferenciação de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano.

METODOLOGIA

Cordões umbilicais (n=20 com 36 a 40 semanas de idade gestacional) foram concedidos por parturientes do Hospital das Clínicas de Pernambuco mediante concordância das mesmas em participar da pesquisa com a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido conforme protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo Seres Humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco – CEP/CCS/UFPE (Protocolo nº482/2010). Os cordões coletados foram processados em um período de seis a 12 horas após parto normal ou cesariano.

Posteriormente, as células foram contadas e plaqueadas a uma concentração de 105 células/mL, em garrafas de 25 cm2 (Cellstar, Greiner/Germany) previamente revestidas com as membranas de biopolímero de cana-de-açúcar como novo suporte.

A confirmação da linhagem mesenquimal foi realizada através da citometria de fluxo (FACScalibur BD®) com o uso de anticorpos monoclonais para células mesenquimais (CD 29, CD 44 e CD 90) e marcadores da linhagem endotelial e hematopoiética (CD 31, CD 34 e CD 45).

As culturas foram acompanhadas semanalmente para avaliação da morfologia e da biocompatibilidade com o biomaterial, com a realização de registros fotográficos através de microscópio invertido com contrate de fase (LEICA) acoplado com Câmera MOTICAN 2000.

A indução da diferenciação das CTMs em queratinócitos sobre os biosuportes foi realizada utilizando-se num processamento adaptado, o meio Stemline™ Keratinocyte Medium II (Sigma-Aldrich®), por um período de 14 dias. A mudança dos aspectos morfológicos das células foi acompanhada com o uso do microscópio óptico invertido com contraste de fase.

RESULTADOS

O estabelecimento da cultura de CTMs da veia do cordão umbilical ocorreu por volta do 3º dia (72h), quando as células apresentaram morfologia fibroblastóide e a formação da monocamada ocorreu com cinco dias de cultivo, onde observamos o tapete celular com algumas áreas abertas a serem posteriormente preenchidas.

A marcação com anticorpos monoclonais revelou os seguintes resultados descritos na tabela 1.

Tabela 1. Marcadores de superfície das CTMs



O uso do biosuporte a base de biopolímero de cana-de-açúcar favoreceu o crescimento de colônias celulares com morfologia variando de arredondadas a fibroblastóides aderidas em ambas as regiões do biomaterial (sobre a membrana e na área aberta correspondente ao poro, plástico da garrafa de cultura) (Figura 1).



Figura 1. Fotomicrografia da cultura de CTMs sobre membrana porosa do biopolímero de cana-de-açúcar observada através de microscópio invertido com contraste de fase. Observam-se células com formato variando de arredondadas a fibroblastóides aderidas em ambas as regiões do biomaterial (sobre a membrana e na área aberta correspondente ao poro, plástico da garrafa de cultura). Escala de barra = 200μm.

A partir de então, as células foram induzidas à diferenciação em queratinócitos sobre a biomembrana, onde se pode observar aglomerados celulares e algumas células com formas arredondadas (Figura 2).

Figura 2. Fotomicrografia da cultura de CTMs sob efeito da indução queratinocítica na membrana do biopolímero de cana-de-açúcar observadas através de microscópio invertido com contraste de fase. Nota-se formações celulares arredondadas e agrupadas sobre a membrana. Escala de barra = 200μm.

DISCUSSÃO

O biopolímero de cana-de-açúcar tem se apresentado como um biomaterial de grande interesse para inúmeros grupos de pesquisa que visam o emprego do mesmo em diferentes áreas de investigação. Esse biomaterial tem sido produzido a partir uma matéria-prima abundante e renovável, como plantios comerciais de cana-de-açúcar do estado de Pernambuco. Portanto, pesquisas dirigidas à utilização do biopolímero de cana-de-açúcar como suporte para o cultivo de células-tronco (CTs), estão começando a despontar como um novo procedimento dentro da área de biomateriais16.

Os componentes de um suporte utilizado no cultivo de células parecem ativar a morfogênese das mesmas, enquanto este é gradualmente degradado e substituído pelo tecido regenerado e a adesão celular é um dos pré-requisitos para a proliferação e diferenciação celular antes da formação do tecido; desse modo, o grau do processo de adesão determina o sucesso de um biomaterial17.

Os aspectos morfológicos evidenciados em nossos resultados revelaram a forma fibroblastóide das células com prolongamentos citoplasmáticos alongados buscando ancoragem em várias direções e consequentemente ampliando o contato entre as mesmas. Em função dessa constatação foi sugerido que essa plasticidade conferida pela adesão e proliferação celular, favoreceu o estabelecimento da biocompatibilidade semelhante àquela observada com suportes comercialmente utilizados. Nossos achados são reforçados por trabalhos da literatura que referem o processo inicial de adesão celular a uma superfície caracterizado por ligações fracas, passando pelo espraiamento celular que favorece a formação de ligações fortes entre a célula e o substrato8,17.

A Imunofenotipagem realizada neste estudo foi de acordo com o que é preconizado pela Sociedade Internacional de Terapia Celular (SITC), onde é necessário que as células apresentem aderência seletiva, em cultura, ao plástico e a expressão de um padrão imunofenotípico condizente com suas características18.

A possibilidade de se obter queratinócitos a partir de células mesenquimais oriundas do sangue de cordão umbilical humano surgiu em função da habilidade dessas células se diferenciarem em diferentes fenótipos celulares e por apresentarem ações antinflamatórias e imuno modulatória que são cruciais especialmente na produção de enxertos para a regeneração da pele19.

O tipo de cultura que apresentamos neste estudo, nos permitiu avaliar a morfologia das CTMs e suas interações célula-célula e célula-matriz utilizando-se como novo suporte membranas de biopolímero de cana-de-açúcar16. Logo, a necessidade de melhor caracterizarmos o processo de diferenciação das CTMs do cordão umbilical em queratinócitos quando cultivadas nas membranas de biopolímero de cana-de-açúcar, parece promissora e deve ser incentivada, podendo abrir novas perspectivas de aplicações no campo da engenharia tecidual.

CONCLUSÃO

As membranas de biopolímeros de cana-de-açúcar foram capazes de favorecer o crescimento e a diferenciação das CTMs em queratinócitos; sendo necessários mais estudos, para considerarmos esses novos biosuportes como alternativas eficazes no tratamento de injúrias relacionadas ao tegumento.

Referências

1. Fernandes JD, Machado MCR, Oliveira ZNP. Prevenção e cuidados com a pele da criança e do recém-nascido. An Bras Dermatol. 2011;86(1):102-10.

2. Coelho MCOC et al. Biopolímero produzido a partir da cana-de-açúcar para cicatrização cutânea. Acta Cirúrgica Brasileira. 2002;17(l):11-13.

3. Monteiro VLC, Coelho MCOC, Carrazzoni PG, Mota RA, Melo FAD, Carvalho EC, Andrade LSS. Cana-de-açúcar no tratamento de feridas cutâneas por segunda ou terceira intenção. Medicina Veterinária (Recife). 2007;1(1):1-8.

4. Ferreira MC, Paggiaro AO, Isaac C, Teixeira Neto N, Santos GB. Substitutos cutâneos: conceitos atuais e proposta de classificação. Rev Bras Cir Plást. 2011;26(4):696-702.

5. Paggiaro AO, Isaac C, Bariani G, Mathor M, Herson MR, Ferreira MC. Construção de equivalente dermo-epidérmico in vitro. Rev Soc Bras Cir Plást. 2007;22(3):153-7.

6. Isaac C, Paggiaro AO, Conduta JL, Aldunate B, Herson MR, Altran SC, Mathor MB, Ferreira MC. Papel do queratinócito na contração da ferida: avaliação de impacto usando um modelo de matriz de colágeno povoada por fibroblastos. Rev Bras Cir Plást. 2011;26(3):402-6.

7. Giuliani A, Manescu A, Larsson E, Tromba G, Luongo G, Piattelli A., Mangano F, Iezzi G, Mangano C. In vivo regenerative properties of coralline-derived (Biocoral) scaffold grafts in human maxillary defects: demonstrative and comparative study with beta-tricalcium phosphate and biphasic calcium phosphate by synchrotron radiation X-Ray microtomography. Clin Implant Dent Relat Res (Hamilton). 2013;DOI 10.1111/cid.12039.

8. Pértile RAN, Siqueira JrJM, Rambo CR, Berti FV, do Valle RMR, Porto LM. Interação de culturas celulares com suportes biopoliméricos para aplicações biomédicas. Exacta. 2007;5(2):343-352.

9. Vilar FO, Vasconcelos GB, Lima RFB, Lima SVC, Aguiar JL. Um novo Material para Tratamento da Incontinência Urinária: Estudo em Ratas. Acta Cir Bras. 2005;20(1):319.

10. Aguiar, JLA, Lins EM, Marques SRB, Coelho ARB, Rossiter RO, Melo RJV. Sug Araújo, P. H. C. de; Dias, M. R. P.; Aguiar, J. L. de A.; Silva, M. B. da; Silva, E. C. da; Medeiros, P. L. de; arcane biopolymer patch in femoral artery angioplasty on dogs. Acta Cirúrgica Brasileira. 2007;22:77-81.

11. Zago MA. Terapia com células tronco: fundamentos, oportunidades e obstáculos. Revista da Sociedade Brasileira de Hipertensão. 2005;8(4):145-50.

12. Kestendjieva S, Kyurkchiev D, Tsvetkova G, Mehandjiev T, Dimitrov A, Nikolov A & Kyurkchiev S. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord. Cell Biology International. 2008;32(7):724-732.

13. Liu ZJ, Zhuge Y, Velazquez OC. Trafficking and differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 2009;106(6):984-991.

14. Springer TA. Adhesion receptors of the immune system, Nature. 1990;346.

15. Silvestri F, Wunder E, Sovalat H, Henon P & Serke S. Positive Selection of CD34+ Cells: A Short Review of the Immunoadsorption Methods Currently Available for Experimental and Clinical Use: Report on the” 2nd European Workshop on Stem Cell Methodology,” Mulhouse, France. Journal of hematotherapy. 1993;2(4):473-481.

16. Barros LA. Aspectos morfofuncionais de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano cultivadas sobre matrizes tridimensionais de biopolímero de cana-de-açúcar. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica da UFPE (Recife/PE). 2013;76.

17. Federman SR, Mansur HS, Stancioli EFB & Vasconcelos WL. Avaliação da biocompatibilidade do compósito aço/filme bioativo SiO2-CaO para aplicação biomédica. Cerâmica. 2009;55(335):257-262.

18. Bydlowski SP, Debes AA, Maselli LMF, Janz FL. Características biológicas das células-tronco mesenquimais, Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 2009;31(1):2535.

19. Toai TC, Thao HD, Thao NP, Gargiulo C, Ngoc PK, Van PH, Strong DM. In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood. Cell Tissue Bank. 2009;doi:10.1007/s10561-0099141-4.